preparatywna i procesowa chromatografia cieczowa, STUDIA, chromatografia

[ Pobierz całość w formacie PDF ]
preparatywna i procesowa chromatografia cieczowa.qxp 2004-06-04 00:45 Page 197
13. PREPARATYWNA I PROCESOWA CHROMATOGRAFIA
CIECZOWA
Marian Kamiñski
13.1. WPROWADZENIE
Chromatografia cieczowa to nie tylko niezast¹piona metoda analityczna o ogromnym
zakresie zastosowañ, ale jest to te¿ metoda separacji s³u¿¹ca do otrzymywania u¿ytkowych iloœ-
ci czystych substancji ze z³o¿onych mieszanin. S¹ takie problemy separacyjne, których
rozwi¹zanie jest dotychczas mo¿liwe tylko metod¹ chromatografii i jest ona, wówczas, niezast¹-
piona. Wiele innych problemów rozdzielczych mo¿na rozwi¹zaæ innymi metodami rozdzielania,
jak ekstrakcja przeciwpr¹dowa, metody str¹ceniowe, membranowe i inne oraz ich kombinacje.
Czêsto okazuje siê, jednak, ¿e chromatografia jest bardziej efektywn¹ i tañsz¹ od innych, metod¹
uzyskania u¿ytkowych iloœci substancji, szczególnie, gdy mo¿na zastosowaæ warunki symulacji
przemieszczania z³o¿a (
Simulated Moving Bed
). Nale¿y te¿ na wstêpie podkreœliæ, ¿e proces
rozdzielania prowadzony z wykorzystaniem chromatografii cieczowej w celu otrzymywania sub-
stancji w postaci czystej, jest tym bardziej efektywny, im wy¿sza jest selektywnoœæ zas-
tosowanego uk³adu rozdzielczego oraz im mniejsze zapewni siê straty eluentu, tzn., im wiêkszy
bêdzie stopieñ zawracania eluentu do procesu. St¹d, m.in., nale¿y unikaæ stosowania warunków
elucji gradientowej w przypadku stosowania chromatografii cieczowej do otrzymywania sub-
stancji w skali procesowej oraz nale¿y zwróciæ szczególn¹ uwagê na eliminacjê strat eluentu.
13.2. G£ÓWNE OBSZARY ZASTOSOWAÑ CHROMATOGRAFII W SKALI
PREPARATYWNEJ I PROCESOWEJ
Chromatografia s³u¿¹ca do otrzymywania czystych substancji ma dwie nazwy:
- chromatografia preparatywna, gdy iloœci otrzymanych substancji s¹ niewielkie, lub otrzymy-
wane s¹ one sporadycznie;
- chromatografia procesowa (produkcyjna), gdy proces prowadzony jest systematycznie, w
sposób cykliczny lub ci¹g³y, a iloœæ produktu jest znacznie wiêksza (np. otrzymywanie pro-
duktu handlowego, sk³adnika leku, enzymu i.t.p.).
Od pocz¹tku stosowania chromatografii, technika ta by³a wykorzystywana dwukierunk-
owo: jako metoda analityczna i jako sposób na wydzielenie z mieszaniny substancji interesu-
j¹cego sk³adnika (lub sk³adników). Przez wiele lat, w okresie poprzedzaj¹cym automatyzacjê i
mikroprocesory, analiza iloœciowa z zastosowaniem chromatografii cieczowej, opiera³a siê na
zbieraniu kolejnych frakcji eluatu i ich analizie typowymi metodami analitycznymi, np. spektro-
fotometrycznymi. Analityk musia³ u¿yæ do dalszej analizy ca³¹ iloœæ rozdzielonej frakcji. Im lep-
sze uzyska³ rozdzielenie, tym wynik by³ bardziej rzetelny.
Na tym etapie rozwoju chromatografii granica pomiêdzy chromatografi¹, jako metod¹
analityczn¹, a metod¹ otrzymywania czystych substancji nie by³a wyraŸna. Wprowadzenie
detektorów przep³ywowych i rejestratorów, a póŸniej komputerów, wyraŸnie rozdzieli³o te dwa
197
 preparatywna i procesowa chromatografia cieczowa.qxp 2004-06-04 00:45 Page 198
obszary zastosowañ chromatografii. W chromatografii analitycznej celem jest uzyskanie rozdzie-
lenia interesuj¹cych (ewentualnie wszystkich) substancji w jak najkrótszym czasie z
R
s
= ok. 1.
D¹¿y siê do zmniejszenia skali procesu przez zmniejszenie wymiarów kolumny, dbaj¹c
równoczeœnie o jej wysok¹ sprawnoœæ. Ze wzglêdu na dobr¹ jakoœæ detektorów iloœæ dozowanej
mieszaniny jest bardzo ma³a i eluat traktowany jest jak zbêdny œciek.
Dzisiaj chromatografia cieczowa jest uwa¿ana za szczególnie efektywn¹ technikê separa-
cyjn¹ w zastosowaniach preparatywnych, tzn., do otrzymywanie czystych substancji dla celów
badawczych lub do mikrosyntez i jest w tym celu bardzo czêsto wykorzystywana w ró¿nych la-
boratoriach. Równie¿ w skali procesowej znajduje korzystne zastosowanie do d³ugookresowego
otrzymywania substancji, gdy chodzi o produkcjê nisko-tona¿ow¹, rzêdu do kilkudziesiêciu kilo-
gramów na dobê i gdy problem rozdzielczy nale¿y do trudnych, lub bardzo trudnych (gdy selek-
tywnoœæ wzglêdna ni¿sza od 1.1). W nowoczesnym przemyœle farmaceutycznym mo¿na dzisiaj
spotkaæ ca³e hale produkcyjne, gdzie znajduj¹ siê jedynie kolumny chromatograficzne i ich
oprzyrz¹dowanie oraz ewentualnie urz¹dzenia do izolacji substancji w postaci krystalicznej z
frakcji zebranego eluatu.
Najwa¿niejsze dziedziny preparatywnych i procesowych zastosowañ chromatografii to:
- izolacja produktów biotechnologii, szczególnie bia³ek i enzymów, polisacharydów, fos-
folipidów, okreœlonych fragmentów DNA, lub RNA itp.;
- izolacja produktów naturalnych pochodzenia roœlinnego lub zwierzêcego,
- izolacja produktów syntezy leków (farmaceutyków, sk³adników kosmetyków, dodatków do
pasz itp.),
- izolacja lantanowców i transuranowców,
- izolacja u¿ytkowych iloœci substancji do badañ i mikrosyntez w zakresie chemii organicznej,
biochemii, mikrobiologii itp.,
- izolacja izomerów optycznych i
- izolacja polimerów o niskim stopniu polidyspersyjnoœci i inne.
13.3. TECHNIKI I MECHANIZMY CHROMATOGRAFII W
ZASTOSOWANIACH PREPARATYWNYCH ORAZ ZASADY
POWIÊKSZANIA SKALI ROZDZIELANIA
Techniki chromatograficzne stosowane w skali preparatywnej i procesowej to:
- Kolumnowa, elucyjna chromatografia cieczowa (PLC) - najwiêksze spektrum zastosowañ,
- Kolumnowa, elucyjna chromatografia gazowa (PGC) - zastosowania g³ównie do izolacji sub-
stancji zapachowych i sk³adników olejków eterycznych,
- Kolumnowa, elucyjna chromatografia z faz¹ ruchom¹ w stanie nadkrytycznym (PSFC) -
potencjalnie najbardziej efektywna ekonomicznie domena zastosowañ chromatografii
preparatywnej, ale dla osi¹gniêcia tego potrzeba rozwi¹zaæ jeszcze wiele problemów tech-
nicznych i teoretycznych,
- Cienkowarstwowa chromatografia preparatywna (PTLC), przydatna do otrzymywania
niewielkich iloœci substancji, a wiêc nie maj¹ca znaczenia procesowaego. Wówczas, gdy
podobna procedura postêpowania zostanie wykonana z zastosowaniem kolumny wype³nionej
aktywowanym sorbentem i wykorzystany zostanie wymuszony przep³yw eluentu w dó³
kolumny, to wydajnoœæ mo¿e byæ ju¿ doœæ wysoka. Metoda bywa nazywana wtedy “Flush
Chromatography”.
W przypadku chromatografii cieczowej celów preparatywnych wykorzystywane s¹ wszy-
stkie poznane chromatograficzne mechanizmy rozdzielcze i wszystkie znane uk³ady chro-
matograficzne. Wykorzystuje siê chromatografiê adsorpcyjn¹ w uk³adzie faz normalnych i
198
 preparatywna i procesowa chromatografia cieczowa.qxp 2004-06-04 00:45 Page 199
odwróconych, chromatografiê jonowymienn¹, mechanizmy sita molekularnego i s¹czenia
molekularnego, chromatografiê powinowactwa, mechanizm oddzia³ywañ hydrofobowych itd.
Stosuje siê przede wszystkim kolumnow¹ chromatografiê elucyjn¹, wykorzystuj¹c te same
wype³nienia kolumn, jak w chromatografii analitycznej, lub o nieco wiêkszych ziarnach oraz
mo¿liwie jak najwy¿szy, mo¿liwy do zastosowania stopieñ tzw. prze³adowania kolumny,
warunkuj¹cy jak najwy¿sz¹ wydajnoœæ otrzymywania substancji. Na rys. 13.1. (2), zamieszczono
przyk³ady chromatogramów, otrzymanych w warunkach braku prze³adowania kolumny (w
warunkach “analitycznych”) oraz z zastosowaniem znacznego stopnia prze³adowania stê¿e-
niowego, albo objêtoœciowego kolumny w uk³adach faz odwróconych albo normalnych. Warun-
ki rozdzielania oraz masy substancji w roztworach dozowanych do kolumny podano na rysunku.
Warto dodaæ, ¿e szczególne us³ugi w zastosowaniach preparatywnych, daje stosowanie
warunków dynamicznie generowanej fazy stacjonarnej w uk³adzie faz normalnych (np. ¿elu
krzemionkowego jako sorbentu i mieszaniny chlorku metylenu i metanolu w ró¿nych sto-
sunkach, z zawartoœci¹ wody o stê¿eniu bliskim nasycenia, np. do rozdzielania glikozydów, alka-
loidów itp. substancji (przyk³ad - chromatogramy na rys. 13.1 a i a').
Najczêœciej, optymalne warunki rozdzielania (selektywnoœæ uk³adu chromatograficznego
i sprawnoœæ kolumny oraz mo¿liwy do osi¹gniêcia stopieñ prze³adowania kolumny, punkty
zbierania frakcji) dobiera siê najpierw w skali tzw. kolumny modelowej o ma³ej œrednicy (4-10
mm). Nastêpnie dokonuje siê powiêkszania skali rozdzielania, przechodz¹c do zastosowania
kolumny o odpowiednio wiêkszej œrednicy, nie zmieniaj¹c ani sorbentu i uk³adu chro-
matograficznego ani d³ugoœci kolumny, czy stê¿enia dozowanego roztworu i rozpuszczalnika do
jego przygotowania. Oblicza siê œrednicê kolumny preparatywnej, konieczn¹ do uzyskania
potrzebnej wydajnoœci rozdzielania, zak³adaj¹c odpowiednie zwiêkszenie objêtoœci dozowanej
mieszaniny substancji rozdzielanych proporcjonalne do stopnia zwiêkszenia pola przekroju
poprzecznego wype³nienia kolumny. Opisan¹ zasadê postêpowania w zwi¹zku z doborem opty-
malnych warunków rozdzielania substancji w skali preparatywnej, albo procesowej naszkicow-
ano schematycznie na rys.13.2.
Warto te¿ zwróciæ uwagê, ¿e w prawie wszystkich w/w domenach zastosowañ chro-
matografii, szczególnie, gdy trzeba rozdzielaæ tylko dwie substancje i gdy nie jest konieczne
stosowanie elucji gradientowej, jest mo¿liwe wykonywanie rozdzielania w warunkach procesu
“pseudo-ci¹g³ego” (SMB). Polega on na równoleg³ej pracy oœmiu do kilkunastu kolumn, przy
czym ka¿da kolumna znajduje siê w innej fazie elucji i w konsekwencji frakcje eluentu, zawier-
aj¹ce poszczególne rozdzielane substancje, s¹ zbierane praktycznie bez przerwy - w sposób
ci¹g³y. W takich warunkach chromatografia mo¿e byæ najbardziej op³acalna ekonomicznie ze
wszystkich metod rozdzielania, mo¿liwych potencjalnie do zastosowania.
13.4. ZJAWISKA PRZE£ADOWANIA KOLUMNY (POWIERZCHNI SORP-
CYJNEJ) I ICH EFEKTYWNE WYKORZYSTANIE W WARUNKACH
CHROMATOGRAFII PREPARATYWNEJ I PROCESOWEJ
W warunkach preparatywnych, w odró¿nieniu od warunków chromatografii analitycznej,
d¹¿y siê do wykorzystania w maksymalnym stopniu tzw. prze³adowania kolumny. Im wy¿szy
udaje siê osi¹gn¹æ stopieñ prze³adowania, tym bardziej efektywny ekonomicznie jest proces
rozdzielczy. Przy czym proces rozdzielania jest szczególnie efektywny, gdy mo¿na uzyskaæ
warunki silnego prze³adowania stê¿eniowego (mo¿liwoœæ rozdzielania jednorazowo do ok.
5 ⋅ 10
-2
g mieszaniny rozdzielanych substancji / g sorbentu typu ¿el krzemionkowy lub chemi-
cznie modyfikowany ¿el krzemionkowy). Mo¿e to, jednak, mieæ miejsce tylko wtedy, gdy roz-
puszczalnoϾ rozdzielanych substancji w eluencie jest dostatecznie wysoka oraz gdy je-
dnoczeœnie selektywnoœæ rozdzielania jest korzystna. Wówczas piki chromatograficzne s¹
199
 preparatywna i procesowa chromatografia cieczowa.qxp 2004-06-04 00:45 Page 200
Rys. 13.1. Zestawienie uzyskanych w praktyce, typowych chromatogramów, ilustruj¹cych ró¿ne
warunki preparatywnego lub procesowego otrzymywania substancji z zastosowaniem kolumnowej
chromatografii cieczowej realizowanej w skali modelowej w warunkach braku prze³adowania (anali-
tycznych) oraz z prze³adowaniem kolumny.
Przyk³ady a, a', b, b', c, c' dotycz¹ optymalnych warunków rozdzielania wybranych substancji, nato-
miast przyk³ady d - f dotycz¹ rozdzielania substancji w niekorzystnych uk³adach chromatograficznych
lub w warunkach znikomej rozpuszczalnoœci substancji rozdzielanych w eluencie.
Opis szczegó³owy na s¹siedniej stronie.
200
 preparatywna i procesowa chromatografia cieczowa.qxp 2004-06-04 00:45 Page 201
Opis do Rys. 1. na s¹siedniej stronie.
a, a' - rozdzielanie lanatozydów A (LA), B (LB), C (LC) z odpadu poprodukcyjnego powsta³ego pod-
czas otrzymywania lanatozydu C metod¹ ekstrakcji p-pr¹dowej. Przyk³ad wykorzystywania chro-
matografii podzia³owej z dynamicznie generowan¹ faz¹ stacjonarn¹ do otrzymywania substancji.
a: warunki prze³adowania (2·10
-3
g
mix
/g
sorb
);
warunki braku prze³adowania ("analityczne");
a': warunki dolnej granicy prze³adowania stê¿eniowego (2·10
-3
g
mix
/g
sorb
);
Warunki chromatograficzne.: kolumna 800x6mm i.d., Kieselgel SI 60 40-63 µm (Merck),
eluent: CH
2
Cl
2
:CH
3
OH:H
2
O 92:8:0,2 v/v,
w
=5ml/min,
detektor UV-254 (KABiD),
czu³oœæ - 1,28 AU/FS (oprócz
: 0,08 AU/FS).
b, b' - rozdzielanie "modelowej" mieszaniny o (oNA), m (mNA), p (pNA)-nitroaniliny w warunkach
chromatografii adsorpcyjnej
b:
b': warunki dolnej granicy prze³adowania (2·10
3
g
mix
/g
sorb
);
Warunki chromatograficzne.: kolumna 100x4mm i.d., Lichrosorb SI 60 5µm,
eluent: Heptan - dioksan 8:2
v/v
, 1ml/min,
detektor UV 280nm (Knauer),
d³ugoœæ drogi optycznej 0,4 mm,
czu³oœæ
b
:
0,08 AU/FS, b': 0,16 AU/FS.
c, c': rozdzielanie modelowej mieszaniny estrów CH
3
-
, C
2
H
5
-
, C
3
H
7
-
kwasu 4 - 0H benzoesowego w
uk³adzie faz odwróconych (RP18),
c: warunki prze³adowania stê¿eniowego (10
-2
g
mix
/g
sorb
),
warunki "analityczne" (10
-5
g
mix
/g
sorb
),
c': warunki dolnej granicy prze³adowania stê¿eniowego (2x10
-4
g
mix
/g
sorb
);
Warunki chromatograficzne: kolumna 120x4mm i.d., Nucleosil RP18 7 µm,
eluent: CH
3
OH - H
2
O 1:1
v/v
, 1ml/min,
detektor UV 280 nm,
d³ugoœæ drogi optycznej 0,4mm (Knauer),
czu³oœæ
c
:
0,08 AU/FS, c': 0,32 AU/FS.
d - rozdzielanie estrów kwasu 4-OH benzoesowego: C3H7- (1), C2H5- (2), CH3- (3) w uk³adzie faz
normalnych na ¿elu krzemionkowym Lichrosorb SI 60 5µm
kolumna 250x4 mm i.d.,
eluent: heptan - dioksan 8:2 V/V, 2ml/min, 254 nm;
warunki granicy prze³adowania stê¿eniowego,
warunki "analityczne";
e,f - rozdzielanie
o
,
m
,
p
- nitroaniliny (patrz rys. 1b, b') w uk³adzie faz odwróconych: Nucleosil C18
7 µm, kolumna 120x4 mm, eluent: CH
3
OH - H
2
O 1:1 v/v, 2 ml/min, e - warunki granicy prze³adowa-
nia stê¿eniowego, f - warunki "analityczne";
g - rozdzielanie benzenu (
c
i
= 2 mg/ml, pik 1) i naftalenu (
c
i
= 0,2 mg/ml, pik 2) w warunkach
znikomej rozpuszczalnoœci substancji w eluencie:
obj. dozowania 2 ml, warunki typowego prze³adowania objêtoœciowego,
obj. dozowania 20 µl warunki "analityczne";
kolumna: Nucleosil C18 7 m, 250x4mm i.d., 1ml/min;
W przypadku chromatogramów e-f: detektor UV 254 nm, droga optyczna 0,4 mm.
201
warunki prze³adowania stê¿eniowego (6·10
-3
g
mix
/g
sorb
),
warunki "analityczne" (6·10
3
g
mix
/g
sorb
),
2,56 AU/FS;
2,56 AU/FS,
[ Pobierz całość w formacie PDF ]